合成生物學研究就像“造汽車”，通過將各類生物“零部件”設計與組裝來構建人工生物系統(tǒng)。生物元件作為“汽車”的基本“零部件”，它的數(shù)量和功能制約著合成生物學的發(fā)展。針對合成生物學元件匱乏這一關鍵問題，定向進化能夠利用進化這個“上帝之手”的力量對已有生物元件進行改造和優(yōu)化，使研究者獲得所需的“定制化功能”，是合成生物學領域的關鍵核心平臺性技術。

　　論文截圖

　　中國科學院深圳先進技術研究院（簡稱“深圳先進院”）劉陳立與傅雄飛團隊基于對微生物在空間上生長遷徙的定量理解，開發(fā)了一種連續(xù)定向進化系統(tǒng)（簡稱“SPACE”），形成了簡便、高效、大規(guī)模定制生物元件的平臺性能力。SPACE系統(tǒng)利用每個普通實驗室都有的小小“平板”，將建庫和篩選生物元件兩個步驟結合在一起，從而實現(xiàn)實驗裝置的高度簡化，成百上千的定向進化實驗可以平行進行，一天時間就可以完成幾十輪的進化。上述成果于9月21日在國際學術期刊《Molecular Systems Biology》上發(fā)表。

　　開辟連續(xù)定向進化的“創(chuàng)新”路徑

　　傳統(tǒng)的定向進化方法一般分為建庫和篩選兩個步驟，多輪進化往往需要進行大量的重復操作，耗費人力物力。2011年美國哈佛大學開發(fā)了噬菌體輔助連續(xù)進化系統(tǒng)（簡稱“PACE”），是定向進化領域一個重大突破。該方法能夠使蛋白質(zhì)在24小時內(nèi)進化60輪，效率是傳統(tǒng)實驗室進化方法的100倍左右，并且整個實驗過程無需人為干預，大大節(jié)省了技術人員的勞動成本。目前，該系統(tǒng)已被廣泛應用于RNA聚合酶、TALEN、Cas9、堿基編輯器等重要酶類的進化改造。

　　然而，如果要同時進化多個目標蛋白，目前還缺少一種簡便的定向進化技術/方法；另一方面，PACE系統(tǒng)需要連續(xù)培養(yǎng)裝置（恒化器，chemostat）、復雜的流速控制與檢測設備和一定的操作技巧，因此普通實驗室不太容易開展PACE實驗。

　　通過借鑒PACE系統(tǒng)中的相關設計，研究團隊將空間尺度引入到了連續(xù)進化系統(tǒng)中，建立了空間噬菌體輔助連續(xù)進化（Spatial phage-assisted continuous evolution, SPACE）系統(tǒng)。該系統(tǒng)不僅大大提升了系統(tǒng)操作的簡便性及元件突變體的篩選效率，為連續(xù)定向進化開辟創(chuàng)新路徑，還具備了合成生物學領域內(nèi)元件開發(fā)優(yōu)化的巨大平臺型技術優(yōu)勢，將為工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學等各方面提供突破性技術助力。

　　解析空間進化規(guī)律 開發(fā)SPACE系統(tǒng)

　　此前，劉陳立團隊在細菌遷徙定植研究中取得了重大突破。研究團隊經(jīng)過5年時間的大量實驗反復研究細菌空間遷徙與進化過程，揭示了物種空間定植的進化穩(wěn)定性策略及定量規(guī)律，為定量合成生物學、生態(tài)學等提供了全新的理論指導和啟示。相關成果于2019年發(fā)表于《自然》。

　　“源于細菌遷徙定植的研究靈感，我們發(fā)現(xiàn)不同的突變體在群體遷移的過程中會相互競爭優(yōu)勢空間，最終使它們占據(jù)了空間上的不同位置，從而實現(xiàn)了不同突變體在空間上的分離”，論文通訊作者劉陳立介紹，目前的連續(xù)定向進化方法都采用均勻混合的液體體系，對有益突變體的篩選只能通過依賴其生長能力的優(yōu)勢，經(jīng)過一定時間段的積累，使其獲得在群體中的主導地位。

　　空間噬菌體輔助連續(xù)進化系統(tǒng)（SPACE系統(tǒng)）的應用展望示意圖 研究團隊供圖

　　是否能讓不同的突變體之間自發(fā)分離，使篩選過程變得更容易？

　　SPACE系統(tǒng)在PACE系統(tǒng)基礎上，利用細菌-噬菌體共遷移實驗體系，使原本沒有運動能力的噬菌體能夠被處于空間擴張運動過程中的細菌攜帶，并廣泛傳播。該共遷移實驗體系與連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的相似性，將原本體積龐大且需要較復雜控制的液體連續(xù)培養(yǎng)裝置替換成了普通生物實驗室中最為常見的軟瓊脂平板。

　　“我們首先基于經(jīng)典的傳染病模型建立了空間擴張系統(tǒng)的宿主感染模型，定量解析了細菌-噬菌體共遷移實驗體系的進化動力學規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了不同強度的噬菌體突變體能夠在空間上出現(xiàn)自發(fā)的分離?；谶@個定量發(fā)現(xiàn)，我們設計開發(fā)了SPACE系統(tǒng)?！闭撐耐ㄓ嵶髡吒敌埏w介紹道。

　　也就是在這樣一塊小小的平板上，SPACE系統(tǒng)能夠利用突變體之間對優(yōu)勢空間的競爭，實現(xiàn)不同強度突變體之間自發(fā)的分離，從而能比均勻混合的液體系統(tǒng)更高效地完成篩選過程。與此同時，進化的成功與否能夠直接通過布滿平板表面的細菌表層上肉眼可見的噬菌體感染區(qū)域的大小來進行判斷，無需借助其他熒光或化學發(fā)光等指示信號的檢測設備。

　　在空間系統(tǒng)中如何實現(xiàn)對噬菌體感染動態(tài)過程的控制、以及對進化初始條件的選擇是研究過程中的較大難點。相較于研究團隊前期建立的細菌空間擴展系統(tǒng)，噬菌體的加入使實驗體系變得更加復雜。在缺乏理論指導的情況下，實驗結果可能由于初始條件的細微變化而產(chǎn)生較大差異，導致進化不能向著需要的方向進行。

　　為了解決這一問題，研究團隊根據(jù)絲狀噬菌體慢性感染的特性，提出了區(qū)別于其他團隊所提出的基于烈性噬菌體感染模型的新模型。并通過對噬菌體感染過程中噬菌體自身的復制動態(tài)、對宿主細菌生長的影響、以及噬菌體感染區(qū)域面積變化等過程進行大量的定量實驗，測定出其中的關鍵參數(shù)用于完善模型。

　　由此建立的定量理論模型，能夠用于預測在采用初始不同強度的基因元件時系統(tǒng)能夠產(chǎn)生的效果，輔助系統(tǒng)中基因線路的設計。

　　小小“平板”讓生物元件進化更快更高效

　　為驗證SPACE系統(tǒng)的有效性，研究團隊利用SPACE系統(tǒng)進行了多組并列進化實驗。經(jīng)過定量實驗表征，得到了相比于原始聚合酶，識別目標啟動子能力最高可達原來的900倍以上的突變體。通過同時進行的大量進化實驗，也讓研究團隊獲得了一個已定量表征活性的聚合酶突變體庫，從中能夠得到聚合酶不同的基因突變信息和活性變化數(shù)據(jù)，這將為后續(xù)聚合酶序列-功能相關的機理研究提供重要的依據(jù)。

　　在已有連續(xù)定向進化方法的基礎上，該項研究通過實驗與模型模擬相結合的方式定量揭示了宿主細菌的空間遷移運動能力對噬菌體進化的作用規(guī)律，在此基礎上利用空間維度發(fā)展了蛋白質(zhì)等生物分子的新型連續(xù)定向進化方法，是定量合成生物學全新研究范式的重要范例。

　　當前，可用的生物元件匱乏成為了合成生物學研究中亟待解決的關鍵問題，SPACE系統(tǒng)可以在普通實驗室中實現(xiàn)生物元件的大規(guī)模平行進化改造，有望為合成生物學在化工、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療等領域的應用提供豐富的元件庫儲備。同時，細菌空間遷移運動對噬菌體進化的作用規(guī)律，也將對于研究更高等的生物，如昆蟲、鳥類的遷徙對其攜帶的可能影響人類健康的病毒如何進化這類生態(tài)學理論或調(diào)查研究，提供參考和示范。（丁寧寧）

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